GC-MS: cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas — definición

Los primeros trabajos de investigación sobre la cromatografía gas-líquido se publicaron en 1950. Los químicos utilizaban diferentes detectores para ver si los compuestos salían por el extremo del cromatógrafo. La mayoría de los detectores destruían los compuestos, porque los quemaban o los ionizaban. Estos detectores dejaban a los químicos adivinando la identidad exacta de cada compuesto de la muestra. En la década de 1950, Roland Gohlke y Fred McLafferty desarrollaron una nueva máquina combinada. Utilizaron un espectrómetro de masas como detector en la cromatografía de gases. Estos primeros aparatos eran grandes, frágiles y, en un principio, estaban limitados al ámbito del laboratorio.

El diseño era complejo. El intervalo de tiempo entre los diferentes compuestos que salían del cromatógrafo era difícil de controlar. Así, el espectrómetro de masas tenía que terminar de trabajar con un compuesto antes de que saliera el siguiente del cromatógrafo. En los primeros modelos, las mediciones del espectrómetro de masas se registraban en papel cuadriculado. Químicos altamente cualificados estudiaban los patrones de los picos para identificar cada compuesto. En la década de 1970, se añadieron convertidores de analógico a digital a los espectrómetros de masas. Esto permitió a los ordenadores almacenar e interpretar los resultados. A medida que los ordenadores se hacían más rápidos y pequeños, la GC-MS se hizo más rápida y se extendió de los laboratorios a la vida cotidiana. Hoy en día, los instrumentos de GC-MS computarizados se utilizan ampliamente en el control medioambiental del agua, el aire y el suelo. También se utiliza en la regulación de la agricultura, la seguridad alimentaria y en el descubrimiento y la producción de medicamentos.

El desarrollo de pequeños ordenadores ha contribuido a la simplificación de las máquinas de GC-MS. También ha reducido en gran medida el tiempo necesario para analizar una muestra. Electronic Associates, Inc. (EAI) era uno de los principales proveedores estadounidenses de ordenadores analógicos. En 1964, EAI comenzó a desarrollar un espectrómetro de masas controlado por ordenador bajo la dirección de Robert E. Finnigan. En 1966, se vendieron más de 500 instrumentos de análisis de gases. En 1967 se creó la Finnigan Instrument Corporation (FIC). A principios de 1968, entregó los primeros prototipos de instrumentos GC-MS de cuatro polos a las universidades de Stanford y Purdue. Con el tiempo, FIC pasó a llamarse Finnigan Corporation y se estableció como líder mundial en sistemas GC-MS.

La GC-MS puede encontrar todos los compuestos mezclados en un objeto de muestra. El operador disuelve la muestra en un líquido. A continuación, el operador inyecta el líquido en una corriente de gas. (El gas fluye a través de un tubo con un revestimiento especial. Como cada compuesto de la muestra se adhiere al revestimiento de forma diferente, cada compuesto sale del tubo en un momento distinto. Así que el recubrimiento se utiliza para separar cada compuesto que se mezcló en la muestra. A medida que cada compuesto sale al final del tubo, se ioniza y obtiene una carga eléctrica. La mayoría de los compuestos se rompen cuando se ionizan. Los diferentes trozos vuelan bajo un imán que separa los trozos en función de su peso y carga. A continuación, un ordenador mide todos los trozos de cada compuesto. Al comparar las mediciones con una biblioteca informática de compuestos conocidos, el ordenador elabora una lista con los nombres de todos los compuestos de la muestra. El ordenador también puede decir qué cantidad de cada compuesto había en la muestra.

La GC-MS se compone de dos elementos principales: el cromatógrafo de gases y el espectrómetro de masas. El cromatógrafo de gases utiliza una columna capilar que depende de las dimensiones de la columna (longitud, diámetro, grosor de la película), así como de las propiedades de la fase (por ejemplo, 5% de fenilpolisiloxano). La diferencia en las propiedades químicas entre las distintas moléculas de una mezcla separará las moléculas a medida que la muestra recorra la longitud de la columna. Las moléculas tardan diferentes cantidades de tiempo (llamado tiempo de retención) en salir (eluir) del cromatógrafo de gases. Esto permite que el espectrómetro de masas, situado a continuación, capture, ionice, acelere, desvíe y detecte las moléculas ionizadas por separado. El espectrómetro de masas hace esto dividiendo cada molécula en fragmentos ionizados y detectando estos fragmentos utilizando su relación masa/carga.

Estas dos máquinas, utilizadas conjuntamente, permiten una precisión mucho mayor en la identificación de sustancias que cualquiera de las dos unidades utilizadas por separado. No es posible realizar una identificación precisa de una molécula concreta mediante la cromatografía de gases o la espectrometría de masas por separado. El proceso de espectrometría de masas requiere normalmente una muestra muy pura. En el pasado, la cromatografía de gases utilizaba otros detectores, como un detector de ionización de llama. Estos detectores no pueden separar moléculas diferentes que casualmente tardan el mismo tiempo en recorrer la columna. (Cuando dos moléculas diferentes tienen el mismo tiempo de retención se dice que "coeluyen"). Las moléculas que coeluyen confunden a los programas informáticos que leen un único espectro de masas para ambas moléculas.

A veces, dos moléculas diferentes también pueden tener un patrón similar de fragmentos ionizados en un espectrómetro de masas (espectro de masas). La combinación de los dos procesos reduce la posibilidad de error. Es muy poco probable que dos moléculas diferentes se comporten de la misma manera tanto en un cromatógrafo de gases como en un espectrómetro de masas. Por lo tanto, si un espectro de masas coincide con el analito de interés, el tiempo de retención de ese espectro puede compararse con un tiempo de retención característico de la GC para aumentar la confianza de que el analito está en la muestra.

Tipos de detectores de espectrómetros de masas

El tipo más común de EM asociado a un GC es el espectrómetro de masas cuadrupolar. Hewlett-Packard (ahora Agilent) lo comercializa con el nombre comercial de "Detector Selectivo de Masas" (MSD). Otro detector relativamente común es el espectrómetro de masas de trampa iónica. Además, se puede encontrar un espectrómetro de masas de sector magnético. Sin embargo, estos instrumentos concretos son caros y voluminosos y no suelen encontrarse en los laboratorios de servicios de alto rendimiento. Se utilizan otros detectores, como los de tiempo de vuelo (TOF), los cuadrupolos en tándem (MS-MS) (véase más adelante), o en el caso de un MS de trampa iónica ⁿ. La n indica el número de etapas de espectrometría de masas.

Un espectrómetro de masas se suele utilizar de dos maneras: Escaneo completo o monitorización selectiva de iones (SIM). El GC-MS típico puede funcionar de cualquiera de las dos maneras por sí solo, o de ambas al mismo tiempo.

Escaneo completo MS

Cuando se recogen datos en el modo de barrido completo, se selecciona un rango objetivo de fragmentos de masa y se introduce en el método del instrumento. Un ejemplo de un amplio rango típico de fragmentos de masa a monitorizar sería de m/z 50 a m/z 400. La determinación del rango a utilizar depende en gran medida de lo que se espera que haya en la muestra, teniendo en cuenta el disolvente y otras posibles interferencias. Si un MS busca fragmentos de masa con un m/z muy bajo, puede detectar aire u otros posibles factores de interferencia. El uso de un rango de barrido grande disminuye la sensibilidad del instrumento. El equipo realizará menos escaneos por segundo porque cada escaneo tardará más tiempo en detectar una gama más amplia de fragmentos de masa.

La exploración completa es útil para determinar compuestos desconocidos en una muestra. Proporciona más información que SIM cuando se trata de confirmar o resolver compuestos en una muestra. La mayoría de los instrumentos están controlados por un ordenador que maneja un programa informático llamado "método del instrumento". El método del instrumento controla la temperatura en el GC, la velocidad de barrido de la EM y el rango de tamaños de fragmentos que se detectan. Cuando un químico está desarrollando un método de instrumento, envía soluciones de prueba a través del GS-MS en modo de barrido completo. De este modo se comprueba el tiempo de retención del GC y la huella de los fragmentos de masa antes de pasar a un método de instrumento SIM. Los instrumentos GC-MS especializados, como los detectores de explosivos, tienen un método instrumental precargado de fábrica.

Control de iones seleccionados

En la monitorización de iones seleccionados (SIM), el método del instrumento se centra en determinados fragmentos de iones. Sólo esos fragmentos de masa son detectados por el espectrómetro de masas. Las ventajas de la SIM son que el límite de detección es más bajo, ya que el instrumento sólo observa un pequeño número de fragmentos (por ejemplo, tres fragmentos) durante cada exploración. Se pueden realizar más escaneos por segundo. Dado que sólo se controlan unos pocos fragmentos de masa de interés, las interferencias de la matriz suelen ser menores. Para mejorar las posibilidades de leer correctamente un resultado positivo, las relaciones iónicas de los distintos fragmentos de masa son comparables a un estándar de referencia conocido.

Tipos de ionización

Después de que las moléculas recorran la longitud de la columna, pasen por la línea de transferencia y entren en el espectrómetro de masas, se ionizan por varios métodos. Normalmente sólo se utiliza un método de ionización en cada momento. Una vez que la muestra se fragmenta, se detecta, normalmente mediante un diodo multiplicador de electrones. El diodo trata el fragmento de masa ionizado como una señal eléctrica que luego se detecta.

Los químicos seleccionan una técnica de ionización independientemente de la elección de la monitorización Full Scan o SIM.

Ionización de electrones

El tipo de ionización más común es la ionización por electrones (EI). Las moléculas entran en el MS (la fuente es un cuadrupolo o la propia trampa de iones en un MS con trampa de iones) donde reciben el impacto de los electrones libres emitidos por un filamento. Es como el filamento que se encuentra en una bombilla incandescente estándar. Los electrones chocan con las moléculas, lo que hace que la molécula se fragmente de una forma característica que puede repetirse. Esta técnica de "ionización dura" da lugar a la creación de más fragmentos de baja relación masa-carga (m/z). La EI tiene pocos fragmentos, o ninguno, que tengan una masa cercana a la de la molécula original. Los químicos consideran que la ionización dura consiste en disparar electrones a las moléculas de la muestra. Por el contrario, la "ionización suave" consiste en colocar una carga en la molécula de la muestra al golpearla con un gas introducido. El patrón de fragmentación molecular depende de la energía de los electrones aplicada al sistema, normalmente 70 eV (voltios de electrones). El uso de 70 eV ayuda a comparar los espectros generados a partir de la muestra de prueba con los espectros conocidos de la biblioteca. (Los espectros de la biblioteca pueden provenir de un software suministrado por el fabricante o de un software desarrollado por el Instituto Nacional de Normas (NIST-USA)). El software busca los espectros de la biblioteca utilizando un algoritmo de coincidencia, como la coincidencia basada en la probabilidad o la coincidencia del producto de punto. Muchos organismos de normalización de métodos controlan ahora estos algoritmos y métodos para garantizar su objetividad.

Ionización química

En la ionización química (IC), se introduce un gas reactivo, normalmente metano o amoníaco, en el espectrómetro de masas. Hay dos tipos de CI: CI positiva o CI negativa. En ambos casos, el gas reactivo interactuará con los electrones y el analito y provocará una ionización "suave" de la molécula de interés. Una ionización más suave fragmenta la molécula en menor grado que la ionización dura de la EI. Los químicos prefieren la IC a la EI. Esto se debe a que la IC produce al menos un fragmento de masa con un peso, que es casi igual al peso molecular del analito de interés.

Ionización química positiva

En la Ionización Química Positiva (IQP) el gas reactivo interactúa con la molécula objetivo, casi siempre con un intercambio de protones. Esto produce la especie iónica en cantidades relativamente altas.

Ionización química negativa

En la Ionización Química Negativa (NCI) el gas reactivo disminuye el impacto de los electrones libres sobre el analito objetivo. Esta disminución de la energía suele dejar el fragmento en gran cantidad. (Los fragmentos no se rompen más).

Interpretación

El objetivo principal del análisis instrumental es medir una cantidad de sustancia. Esto se hace comparando las concentraciones relativas entre las masas atómicas en el espectro de masas generado. Son posibles dos tipos de análisis, el comparativo y el original. El análisis comparativo esencialmente compara el espectro dado con una biblioteca de espectros para ver si sus características están presentes para alguna muestra conocida en la biblioteca. Esto se realiza mejor con un ordenador porque hay muchas distorsiones visuales que pueden tener lugar debido a las variaciones de escala. Los ordenadores también pueden correlacionar más datos (como los tiempos de retención identificados por la GC), para relacionar con mayor precisión ciertos datos.

Otro método de análisis mide los picos en relación con los demás. En este método, el pico más alto se fija en el 100%. A los demás picos se les asigna un valor igual a la relación entre la altura del pico y la altura del pico más alto. Se asignan todos los valores superiores al 3%. La masa total del compuesto desconocido se indica normalmente mediante el pico padre. El valor de este pico padre puede utilizarse para ajustarse a una fórmula química que contenga los distintos elementos que se cree que están en el compuesto. El patrón isotópico en el espectro es único para los elementos que tienen muchos isótopos. Por tanto, también puede utilizarse para identificar los distintos elementos presentes. Esto indica la fórmula química global de la molécula desconocida. Dado que la estructura y los enlaces de una molécula se rompen de forma característica, pueden identificarse a partir de la diferencia de masas de los picos. La estructura de la molécula identificada debe ser coherente con las características registradas por la GC-MS. Normalmente, esta identificación se realiza automáticamente mediante programas informáticos que vienen con el instrumento. Estos programas comparan los espectros con una biblioteca de compuestos conocidos que tienen la misma lista de elementos que podrían estar presentes en la muestra.

Un análisis de "espectro completo" tiene en cuenta todos los "picos" de un espectro. Sin embargo, la monitorización selectiva de iones (SIM) sólo controla los picos seleccionados asociados a una sustancia específica. Los químicos parten de la base de que, en un tiempo de retención determinado, un conjunto de iones es característico de un determinado compuesto. SIM es un análisis rápido y eficaz. SIM funciona mejor cuando el analista tiene información previa sobre una muestra o sólo busca unas pocas sustancias específicas. Cuando la cantidad de información recogida sobre los iones en un pico cromatográfico de gases determinado disminuye, la sensibilidad del análisis aumenta. Así, el análisis SIM permite detectar y medir una cantidad menor de un compuesto. Pero el grado de certeza sobre la identidad de ese compuesto se reduce.

GC-tandem MS

Cuando se añade una segunda fase de fragmentación de masas, por ejemplo utilizando un segundo cuadrupolo en un instrumento cuadrupolar, se denomina MS en tándem (MS/MS). Las MS/MS son buenas para medir niveles bajos de compuestos objetivo en una muestra con una matriz de compuestos de fondo que no son de interés.

El primer cuadrupolo (Q1) está conectado con una célula de colisión (q2) y otro cuadrupolo (Q3). Ambos cuadrupolos pueden utilizarse en modo de barrido o estático, dependiendo del tipo de análisis MS/MS utilizado. Los tipos de análisis incluyen el escaneo de iones producto, el escaneo de iones precursores, la monitorización de reacciones seleccionadas (SRM) y el escaneo de pérdidas neutras. Por ejemplo: Cuando Q1 está en modo estático (mirando una sola masa como en SIM), y Q3 está en modo de barrido, se obtiene el llamado espectro de iones producto (también llamado "espectro hija"). A partir de este espectro, se puede seleccionar un ion producto prominente que puede ser el ion producto para el ion precursor elegido. Este par se denomina "transición" y constituye la base del SRM. El SRM es altamente específico y elimina casi por completo el fondo de la matriz.

Control y limpieza del medio ambiente

Muchos químicos creen que la GC-MS es la mejor herramienta para controlar los contaminantes orgánicos en el medio ambiente. El coste de los equipos de GC-MS ha disminuido mucho. La fiabilidad de la GC-MS ha aumentado al mismo tiempo. Ambas mejoras han incrementado su uso en los estudios medioambientales. Algunos compuestos, como ciertos pesticidas y herbicidas, no pueden ser identificados por GS-MS. Son demasiado similares a otros compuestos relacionados. Pero para la mayoría de los análisis orgánicos de las muestras ambientales, incluidas muchas clases importantes de pesticidas, la GC-MS es muy sensible y eficaz.

Criminalística

La GC-MS puede analizar las partículas de un cuerpo humano para ayudar a relacionar a un criminal con un delito. La ley acepta el uso de la GC-MS para analizar los restos de un incendio. De hecho, la Sociedad Americana de Ensayos de Materiales (ASTM) tiene una norma para el análisis de restos de incendios. La GCMS/MS es especialmente útil en este caso, ya que las muestras suelen contener matrices muy complejas y los resultados, utilizados en los tribunales, deben ser muy precisos.

Aplicación de la ley

La GC-MS se utiliza para la detección de estupefacientes ilegales y puede llegar a sustituir a los perros detectores de drogas. También se utiliza habitualmente en toxicología forense. Ayuda a encontrar drogas y/o venenos en muestras biológicas tomadas de sospechosos, víctimas o un cadáver.

Seguridad

Tras los atentados terroristas del 11 de septiembre de 2001, los sistemas de detección de explosivos han pasado a formar parte de todos los aeropuertos estadounidenses. Estos sistemas funcionan con una gran cantidad de tecnologías, muchas de ellas basadas en GC-MS. Sólo hay tres fabricantes certificados por la FAA para suministrar estos sistemas. El primero es Thermo Detection (antes Thermedics), que produce el EGIS, una línea de detectores de explosivos basada en GC-MS. La segunda es Barringer Technologies, que ahora es propiedad de Smith's Detection Systems. La tercera es Ion Track Instruments (parte de General Electric Infrastructure Security Systems).

Análisis de alimentos, bebidas y perfumes

Los alimentos y las bebidas contienen muchos compuestos aromáticos, algunos presentes de forma natural en las materias primas y otros que se forman durante el procesamiento. La GC-MS se utiliza ampliamente para el análisis de estos compuestos, que incluyen ésteres, ácidos grasos, alcoholes, aldehídos, terpenos, etc. También se utiliza para detectar y medir los contaminantes procedentes del deterioro o la adulteración que pueden ser perjudiciales. Los contaminantes suelen estar controlados por los organismos gubernamentales, por ejemplo los pesticidas.

Astroquímica

Varios GC-MS han salido de la Tierra. Dos fueron a Marte en el programa Viking. Venera 11 y 12 y Pioneer Venus analizaron la atmósfera de Venus con GC-MS. La sonda Huygens de la misión Cassini-Huygens hizo aterrizar un GC-MS en la mayor luna de Saturno, Titán. El material del cometa 67P/Churyumov-Gerasimenko será analizado por la misión Rosetta con una GC-MS quiral en 2014.

Medicina

Los GC-MS se utilizan en las pruebas de cribado de los recién nacidos. Estas pruebas pueden detectar docenas de enfermedades metabólicas congénitas (también conocidas como errores innatos del metabolismo). La GC-MS puede determinar compuestos en la orina incluso en cantidades muy pequeñas. Estos compuestos normalmente no están presentes pero aparecen en individuos que sufren trastornos metabólicos. Esto se está convirtiendo en una forma habitual de diagnosticar los EIM para poder realizar un diagnóstico más temprano y comenzar el tratamiento. Esto conduce finalmente a un mejor resultado. Ahora es posible analizar a un recién nacido para detectar más de 100 trastornos metabólicos genéticos mediante un análisis de orina al nacer basado en la GC-MS.

En combinación con el etiquetado isotópico de compuestos metabólicos, la GC-MS se utiliza para determinar la actividad metabólica. La mayoría de las aplicaciones se basan en el uso de ¹³C como etiquetado y la medición de las relaciones ¹³C-¹² C con un espectrómetro de masas de relación isotópica (IRMS). Un IRMS es un espectrómetro de masas con un detector diseñado para medir unos pocos iones seleccionados y devolver los valores como ratios.