Constructo de ADN: definición y usos en expresión génica y biología molecular

Constructo de ADN: definición, tipos y aplicaciones en expresión génica y biología molecular para diseñar, expresar o silenciar genes y estudiar proteínas y ARN.

Una construcción de ADN es un segmento de ácido nucleico construido artificialmente que va a ser "trasplantado" a un tejido o célula objetivo.

Suele contener un inserto de ADN, que contiene la secuencia genética que codifica una proteína de interés. El inserto de ADN se ha subclonado en un vector de biología molecular.

Una construcción de ADN puede expresar una proteína de tipo salvaje o impedir la expresión de determinados genes mediante la expresión de competidores o inhibidores. Puede expresar proteínas mutantes, como mutaciones de deleción o mutaciones sin sentido. Una construcción de ADN se utiliza a menudo en biología molecular para analizar con más detalle macromoléculas como las proteínas o el ARN.

Componentes habituales de una construcción de ADN

• Inserto: la secuencia codificante o reguladora que se quiere estudiar o expresar (gen completo, fragmento, ARNi, sgRNA, etc.).
• Promotor: elemento que dirige la transcripción (p. ej., promotores constitutivos como CMV o específicos de tejido). Puede ser inducible o regulable.
• Etiqueta (tag): secuencias para facilitar detección o purificación (His, FLAG, GFP, etc.), que pueden estar en el extremo N o C de la proteína.
• Marcador de selección: genes que permiten seleccionar células transformadas (resistencia a antibióticos, marcadores de auxotrofía, fluorescencia).
• Origen de replicación (ori): determina el número de copias del vector en hospedadores bacterianos.
• Secuencias reguladoras y terminadores: UTRs, señales de poliadenilación (polyA), sitios de procesamiento de ARN y terminadores de transcripción.
• Elementos multicistrónicos: IRES o péptidos 2A para expresar varias proteínas desde un mismo mensajero.

Métodos habituales para construir un plásmido

• Clonación por restricción-ligación: uso de enzimas de restricción y ligasas para insertar fragmentos.
• PCR y subclonación: amplificación dirigida de fragmentos con cebadores diseñados.
• Ensamblajes sin restricciones: técnicas modernas como Gibson Assembly, In-Fusion o ensamblaje por recombinación (Gateway) que facilitan montar múltiples fragmentos.
• Mutagénesis dirigida: para introducir mutaciones puntuales, deleciones o inserciones (site-directed mutagenesis).
• Síntesis de ADN: compra de genes o fragmentos sintetizados, especialmente útil para secuencias optimizadas o recalcitrantes a la clonación.

Tipos de vectores y hospedadores

• Bacterianos (E. coli): para propagación y producción de proteínas sencillas; vectores con orígenes de alta o baja copia, promotores T7, etc.
• Levaduras eucariotas: para proteínas con modificaciones postraduccionales propias de eucariotas.
• Sistemas de insectos: baculovirus para producción de proteínas complejas.
• Mamíferos: vectores diseñados para expresión en líneas celulares, con promotores específicos y señales de señalización/retención.
• Vectores virales: lentivirus, adenovirus o AAV para entrega eficiente a células o tejidos in vivo o para líneas celulares difíciles de transfectar.

Aplicaciones principales

• Expresión proteica: producir proteínas recombinantes para caracterización bioquímica o estructural.
• Estudios funcionales: sobreexpresión, deleción funcional, ensayos de rescate y análisis de mutantes.
• Localización celular: fusión con GFP u otras etiquetas para ver la distribución subcelular.
• Interacciones proteína–proteína: ensayos de co-inmunoprecipitación, BiFC, pull-down con etiquetas.
• Regulación génica: reporteros para estudiar promotores, potenciadores o respuesta a señales (luciferasa, β-galactosidasa).
• Silenciamiento y edición génica: expresión de ARN interferente (siRNA/shRNA) o sistemas de edición como CRISPR/Cas para modificar loci genómicos.
• Producción de ARN no codificante: para estudiar funciones de miARN, lncRNA u otros elementos reguladores.

Consideraciones prácticas y de diseño

• Marco de lectura y codones: comprobar que la inserción está en el marco correcto y, si procede, optimizar la codificación para el hospedador.
• Presencia de codón de parada: dependiendo de si se desea una etiqueta de fusión, hay que incluir o excluir el codón de parada.
• Orientación y elementos reguladores: verificar orientación del inserto respecto al promotor y la ausencia de elementos no deseados.
• Verificación: secuenciación completa del inserto y de las uniones, análisis de expresión por RT-qPCR y Western blot, y ensayos funcionales.
• Control de copia y expresión: elegir promotores y orígenes adecuados para evitar expresión tóxica o niveles demasiado bajos.
• Seguridad y bioética: cumplir normas de bioseguridad, niveles de contención y regulaciones locales para trabajo con vectores y organismos modificados.

Limitaciones y precauciones

• Las construcciones pueden producir efectos fuera de objetivo (off-target) o respuestas celulares no deseadas; se recomienda usar controles apropiados.
• La expresión en sistemas heterólogos puede no reproducir modificaciones postraduccionales nativas.
• En aplicaciones terapéuticas o in vivo se requiere una evaluación rigurosa de seguridad, inmunogenicidad y persistencia del vector.

En resumen, una construcción de ADN es una herramienta versátil en investigación y biotecnología que, bien diseñada y verificada, permite manipular y estudiar la función de genes y macromoléculas en una amplia variedad de contextos experimentales.

Vectores de biología molecular

Un vector de biología molecular es una molécula de ADN utilizada como vehículo para transferir material genético extraño a otra célula.

Los principales tipos de vectores son los plásmidos, los bacteriófagos y otros virus, y los cromosomas artificiales. Todos los vectores diseñados tienen en común un origen de replicación, un sitio de multiclonación y un marcador seleccionable.

El vector en sí es generalmente una secuencia de ADN que consiste en un inserto (transgén) y una secuencia mayor que sirve como "columna vertebral" del vector. La columna vertebral incluirá genes de resistencia bacteriana para el crecimiento en las bacterias, y promotores para la expresión en el organismo.

El objetivo de un vector que transfiere información genética a otra célula suele ser aislar, multiplicar o expresar el inserto en la célula objetivo.

La inserción de un vector en la célula objetivo suele denominarse transformación en el caso de las células bacterianas, o transfección en el caso de las células eucariotas. La inserción de un vector viral suele denominarse transducción.

Hay dos tipos de integración de plásmidos en una bacteria huésped: Los plásmidos no integrados se replican como en el caso superior, mientras que los episomas, el ejemplo inferior, se integran en el cromosoma del huésped.

Preguntas y respuestas

P: ¿Qué es una construcción de ADN?

P: ¿Qué suele contener un constructo de ADN?

P: ¿Qué es un vector de biología molecular?

P: ¿Cómo puede una construcción de ADN impedir la expresión de determinados genes?

P: ¿Qué tipos de proteínas mutantes puede expresar una construcción de ADN?

P: ¿Cuál es el propósito de utilizar una construcción de ADN en biología molecular?

P: ¿Qué tipos de proteínas puede expresar una construcción de ADN?

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